瓊脂糖凝膠過(guò)濾基質(zhì)樹(shù)脂填料 Smartaroe 蛋白純化

Smartarose是一種球形瓊脂糖凝膠過(guò)濾基質(zhì)，Smartarose 4B和Smartarose 6B的瓊脂糖含量分別為4%和6%o Smartarose CL凝膠是 Smartarose 4B和Smartarose 6B的衍生物，化學(xué)和物理性能更優(yōu)異，流速更快。Smartarose CL凝膠耐有機(jī)溶劑，因此適合在有機(jī)溶劑 中分離物質(zhì)。Smartarose和Smartarose CL分離范圍較廣，適合對(duì)分子量不同的樣品進(jìn)行表征或分離。

瓊脂糖凝膠過(guò)濾基質(zhì)樹(shù)脂填料 Smartaroe 蛋白純化性能

   pH范圍是我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)估算的。請(qǐng)注意：pH長(zhǎng)期穩(wěn)定性是指凝膠在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)其層析性能不會(huì)改變的pH范圍。pH短期穩(wěn)定性是指凝膠再生和清洗時(shí)穩(wěn)定的pH范圍。

裝柱說(shuō)明：

介質(zhì)保存于20%乙醇。裝柱前建議將20%乙醇抽濾去除，置換成去離子水。

將75%介質(zhì)和25%去離子水混句，真空負(fù)壓脫氣。不要使用粘性試劑裝柱。裝柱完成后，可以用粘性緩沖液低流速平衡層析柱。

2.2介質(zhì)裝填

裝柱方法有兩步，第二步應(yīng)在恒壓下進(jìn)行，柱壓見(jiàn)表2。凝膠層析的分辨率隨柱床高度的增加而增加。因此，柱床高度最好在60 cm以上。

表2.推薦裝柱流速和壓力

V：所需介質(zhì)體積ml

1.15：壓縮系數(shù)（不同介質(zhì)壓縮系數(shù)不同）

r：柱管半徑cm

h：裝填高度cm

1） 用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無(wú)氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去離子水。

2） 將填料懸浮起來(lái)，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3） 如果使用儲(chǔ)液器，應(yīng)立即在層析柱和儲(chǔ)液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。

4） 打開(kāi)層析柱底部出口，開(kāi)啟泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過(guò)層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液 壓對(duì)所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，這樣也可以得到 一個(gè)很好的裝填效果。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過(guò)最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上2 倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5） 關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6） 如果使用儲(chǔ)液器，去除儲(chǔ)液器，將分配器置于層析柱中。

7） 將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。

8） 將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開(kāi)始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

2.3柱效測(cè)試

為了檢驗(yàn)層析柱的質(zhì)量，應(yīng)進(jìn)行柱效測(cè)試，以確定理論塔板數(shù)和峰不對(duì)稱系數(shù)。

洗脫液：去離子水

樣品：2% （v/v）丙酮水溶液或者1 M NaCI溶液

如圖1所示計(jì)算理論塔板數(shù)，用如下公式：N/m = 5.54 （VrM）2 x 1000/L

計(jì)算峰不對(duì)稱系數(shù)（AS）公式如下：AS = b/a （如圖1所示）

3 .純化流程

3.1緩沖液的準(zhǔn)備

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 pm或0.45 pm濾膜過(guò)濾。

平衡液為蛋白純化后，用于保護(hù)蛋白的溶液，根據(jù)客戶需求自行選擇。

3.2樣品準(zhǔn)備

樣品在上樣前建議離心或用0.22 pm或0.45|jm濾膜過(guò)濾，減少雜質(zhì)，防止堵塞柱子。

3.3樣品純化

1） 平衡

上樣之前，用平衡液至少平衡兩個(gè)柱體積，或直到基線穩(wěn)定。含去垢劑的溶液可能需要平衡更長(zhǎng)時(shí)間。

2） 上樣

推薦上樣體積為柱體積的2-5%o可以通過(guò)上樣管或樣品環(huán)來(lái)上樣。純化流速最高不能超過(guò)裝柱流速的70%0

3） 再生

再生通常用水沖洗2倍柱體積，然后用緩沖液沖洗2-3倍柱體積，如果不立刻使用，則用20%乙醇平衡后，4-30°C保存。對(duì)不同的樣品, 建議大約5次循環(huán)后，采用完整的在位清洗（CIP）o

4.清洗及保存

4.1 CIP （Cleaning In Place）清洗

CIP是去除以前生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的結(jié)合過(guò)緊密、沉淀或變性的物質(zhì)。在某些情況下，介質(zhì)再生后，月謳或變性蛋白跡物質(zhì)仍可育誡留茁掃=o 需要制鵰料中已知污染I刎樓來(lái)設(shè)H特定的CIP程序。

當(dāng)出現(xiàn)下列情況，需要對(duì)介質(zhì)進(jìn)行在位清洗：

•柱壓增高；

•填料顏色變化明顯；

•分辨率降低；

•上接頭與凝膠表面之間出現(xiàn)空隙；

•如果反壓增高，在介質(zhì)清洗前檢查閥門(mén)、管線等中止情況。

1） 去除非特異性結(jié)合蛋白和脂蛋白

用0.5 M NaOH清洗一個(gè)柱體積，去離子水或緩沖液平衡至中性，流速40 cm/ho

2） 去除一些沉淀或變性物質(zhì)，建議使用下面的方法

用4倍柱體積的1.0-2.0 M NaOH溶液，流速40 cm/h對(duì)介質(zhì)進(jìn)行清洗，然后立即用2-3倍柱體積的水清洗。

3） 去除一些強(qiáng)結(jié)合的疏水蛋白

用4-10倍柱體積的70%乙醇或30%異丙醇清洗（使用有機(jī)溶劑要梯度清洗，避免起泡）或者用含去垢劑的酸或中性溶液。比如，用1 M 醋酸溶液含0.5%非離子型去垢劑，清洗流速40 cm/h。隨后用70%乙醇沖洗5個(gè)柱體積洗去殘留去垢劑。

4.2保存

CIP之后的介質(zhì)如果不使用可以用20%乙醇，4 -30°C保存。

5 .訂購(gòu)信息及相關(guān)產(chǎn)品

         蘇州阿爾法生物提供的瓊脂糖凝膠介質(zhì)、葡聚糖凝膠介質(zhì)等蛋白純化和分離填料以及相關(guān)生物試劑。另外還提供、組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì)、GST-tag蛋白親和純化介質(zhì)、 MBP-tag蛋白親和純化介質(zhì)、生物素Biotin-tag蛋白親和純化介質(zhì)、Strep-tagll標(biāo)簽親和純化介質(zhì)、 標(biāo)簽抗體親和純化介質(zhì)等標(biāo)簽蛋白親和層析介質(zhì)； 離子交換層析 、色譜柱、離子交換層析樹(shù)脂、疏水層析介質(zhì)、 磁性微球等。